Жидкостная хроматография. Высокоэффективная жидкостная хроматография (вэжх) Вэжх высокоэффективная жидкостная хроматография

Введение

Глава 1. Основные понятия и классификация методов жидкостной хроматографии

1.1 Аппаратура для жидкостной хроматографии

Глава 2. Сущность ВЭЖХ

2.1 Применение

Глава 3. Примеры использования ВЭЖХ в анализе объектов окружающей среды

Глава 4. Аппаратура для ВЭЖХ

Литература

Приложение

Введение

Хроматографические методы часто оказываются незаменимыми для идентификации и количественного определения органических веществ со сходной структурой. При этом наиболее широко используемыми для рутинных анализов загрязнителей окружающей среды являются газовая и высокоэффективная жидкостная хроматография. Газохроматографический анализ органических загрязнителей в питьевой и сточных водах сначала основывался на использовании насадочных колонок, позднее распространение получили и кварцевые капиллярные колонки. Внутренний диаметр капиллярных колонок составляет обычно 0,20-0,75 мм, длина - 30-105 м. Оптимальные результаты при анализе загрязнителей в воде достигаются чаще всего при использовании капиллярных колонок с различной толщиной пленки из метилфенилсиликонов с содержанием фенильных групп 5 и 50%. Уязвимым местом хроматографических методик с использованием капиллярных колонок часто становится система ввода пробы. Системы ввода пробы можно подразделить на две группы: универсальные и селективные. К универсальным относятся системы ввода с делением и без деления потока, “холодный” ввод в колонку и испарение при программировании температуры. При селективном вводе используют продувку с промежуточным улавливанием в ловушке, парофазный анализ и т.д. При использовании универсальных систем ввода в колонку поступает вся проба полностью, при селективной инжекции вводится только определенная фракция. Результаты, получаемые при селективном вводе, являются существенно более точными, поскольку попавшая в колонку фракция содержит только летучие вещества, и техника при этом может быть полностью автоматизирована.

Газохроматографические детекторы, используемые в мониторинге загрязнителей, часто подразделяют на универсальные, откликающиеся на каждый компонент в подвижной фазе, и селективные, реагирующие на присутствие в подвижной фазе определенной группы веществ со сходными химическими характеристиками. К универсальным относятся пламенно-ионизационный, атомно-эмиссионный, масс-спектрометрический детекторы и инфракрасная спектрометрия. Селективными детекторами, используемыми в анализе воды, являются электронно-захватный (селективен к веществам, содержащим атомы галогенов), термоионный (селективен к азот- и фосфорсодержащим соединениям), фотоионизационный (селективен к ароматическим углеводородам), детектор по электролитической проводимости (селективен к соединениям, содержащим атомы галогенов, серы и азота). Минимально детектируемые количества веществ - от нанограммов до пикограммов в секунду.

Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) является идеальным методом для определения большого числа термически неустойчивых соединений, которые не могут быть проанализированы с помощью газовой хроматографии. Объектами анализа методом жидкостной хроматографии в настоящее время часто становятся современные агрохимикаты, в число которых входят метилкарбонаты и фосфорорганические инсектициды, другие нелетучие вещества. Высокоэффективная жидкостная хроматография получает все большее распространение среди других методов, применяемых в мониторинге окружающей среды, еще и потому, что имеет блестящие перспективы в плане автоматизации пробоподготовки.

ГЛАВА 1. ОСНОВНЫЕ ПОНЯТИЯ И КЛАССИФИКАЦИЯ МЕТОДОВ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

Жидкостную хроматографию подразделяют на несколько классов в зависимости от типа носителя неподвижной фазы. Простое аппаратурное оформление бумажной и тонкослойной хроматографий обусловили широкое использование этих методов в аналитической практике. Однако, большие возможности колоночной жидкостной хроматографии стимулировали совершенствование оборудования для этого классического метода и привели к быстрому внедрению ВЭЖХ. Пропускание элюента через колонку под высоким давлением позволило резко увеличить скорость анализа и существенно повысить эффективность разделения за счет использования мелкодисперсного сорбента. Метод ВЭЖХ в настоящее время позволяет выделять, количественно и качественно анализировать сложные смеси органических соединений.

По механизму взаимодействия разделяемого вещества (элюата) с неподвижной фазой различают адсорбционную, распределительную, ионообменную, эксклюзионную, ион-парную, лигандообменную и аффинную хроматографии.

Адсорбционная хроматография . Разделение методом адсорбционной хроматографии осуществляется в результате взаимодействия разделяемого вещества с адсорбентом, таким как оксид алюминия или силикагель, имеющими на поверхности активные полярные центры. Растворитель (элюент) - неполярная жидкость. Механизм сорбции состоит в специфическом взаимодействии между полярной поверхностью сорбента и полярными (либо способными поляризоваться) участками молекул анализируемого компонента (рис. 1).

Рис. 1. Адсорбционная жидкостная хроматография.

Распределительная хроматография . При распределительном варианте жидкостной хроматографии разделение смеси веществ осуществляется за счет различия их коэффициентов распределения между двумя несмешивающимися фазами - элюентом (подвижной фазой) и фазой, находящейся на сорбенте (неподвижная фаза).

При нормально-фазовом варианте распределительной жидкостной хроматографии используются неполярный элюент и полярные группы, привитые к поверхности сорбента (чаще всего силикагеля). В качестве модификаторов поверхности силикагеля (привитых фаз) используются замещенные алкилхлорсиланы, содержащие полярные группы, такие как нитрильная, аминогруппа и т. д. (рис. 2). Применение привитых фаз позволяет тонко управлять сорбционными свойствами поверхности неподвижной фазы и добиваться высокой эффективности разделения.

Рис. 2. Распределительная хроматография с привитой фазой (нормально-фазный вариант).

Обращенно-фазовая жидкостная хроматография основана на распределении компонентов смеси между полярным элюентом и неполярными группами (длинными алкильными цепочками), привитыми к поверхности сорбента (рис. 3).

Рис. 3. Распределительная хроматография с привитой фазой (обращенно-фазный вариант).

Менее широко используется вариант жидкостной хроматографии с нанесенными фазами, когда жидкая неподвижная фаза наносится на неподвижный носитель.

Эксклюзивная (гельпроникающая) хроматография представляет собой вариант жидкостной хроматографии, в котором разделение веществ происходит за счет распределения молекул между растворителем, находящимся в порах сорбента и растворителем, протекающим между его частицами.

Аффинная хроматография основана на специфических взаимодействиях разделяемых белков (антител) с привитыми на поверхности сорбента (синтетической смолы) веществами (антигенов), избирательно образующими с белками комплексы (коньюгаты).

Ионообменная, ион-парная, лигандообменная хроматографии применяются в основном в неорганическом анализе.

Основные параметры хроматографического разделения.

Основными параметрами хроматографического разделения являются удерживаемый объем и время удерживания компонента смеси (рис. 4).

Время удерживания tR - это время, прошедшее от момента ввода пробы в колонку до выхода максимума соответствующего пика. Умножив время удерживания на объемную скорость элюента F , получим удерживаемый объем VR:

Исправленое время удерживания - время, прошедшее с момента появления максимума пика несорбируемого компонента до пика соответствующего соединения:

tR" = tR - t0;

Приведенный или исправленный объем удерживания - это объем удерживания с поправкой на мертвый объем колонки V0, т. е. на объем удерживания несорбируемого компонента:

VR" = VR - V0;

Характеристикой удерживания является также коэффициент емкости k", определяемый как отношение массы вещества в неподвижной фазе к массе вещества в подвижной фазе: k" = mн / mп;

Величину k" легко определить по хроматограмме:

Важнейшими параметрами хроматографического разделения являются его эффективность и селективность.

Эффективность колонки, измеряемая высотой теоретических тарелок (ВЭТТ) и обратно пропорциональная их числу (N) тем выше, чем уже пик вещества, выходящего при том же времени удерживания. Значение эффективности может быть вычислено по хроматограмме по следующей формуле:

N = 5.54 . (tR / 1/2) 2 ,

где tR - время удерживания,

w 1/2 - ширина пика на половине высоты

Зная число теоретических тарелок, приходящееся на колонку, длину колонки L и средний диаметр зерна сорбента dc, легко получить значения высоты, эквивалентной теоретической тарелке (ВЭТТ), и приведенной высоты (ПВЭТТ):

ВЭТТ = L/N ПВЭТТ = ВЭТТ/d c

Эти характеристики позволяют сравнивать эффективности колонок различных типов, оценивать качество сорбента и качество заполнения колонок.

Селективность разделения двух веществ определяется по уравнению:

При рассмотрении разделения смеси двух компонентов важным параметром служит также степень разделения RS:

;

Пики считаются разрешенными, если величина RS больше или равна 1.5.

Основные хроматографические параметры связывает следующее уравнение для разрешения:

;

Факторами, определяющими селективность разделения, являются:

1) химическая природа сорбента;

2) состав растворителя и его модификаторов;

3) химическая структура и свойства компонентов разделяемой смеси;

4) температура колонки

1.1 Аппаратура для жидкостной хроматографии

В современной жидкостной хроматографии используют приборы различной степени сложности - от наиболее простых систем, до хроматографов высокого класса, снабженных различными дополнительными устройствами.

На рис. 4. представлена блок-схема жидкостного хроматографа, содержащая минимально необходимый набор составных частей, в том или ином виде, присутствующих в любой хроматографической системе.

Рис. 4. Блок-схема жидкостного хроматографа.

Насос (2) предназначен для создания постоянного потока растворителя. Его конструкция определяется, прежде всего, рабочим давлением в системе. Для работы в диапазоне 10-500 МПа используются насосы плунжерного (шприцевого), либо пистонного типов. Недостатком первых является необходимость периодических остановок для заполнения элюентом, а вторых - большая сложность конструкции и, как следствие, высокая цена. Для простых систем с невысокими рабочими давлениями 1-5 МПа с успехом применяют недорогие перистальтические насосы, но так как при этом трудно добиться постоянства давления и скорости потока, их использование ограничено препаративными задачами.

Инжектор (3) обеспечивает ввод пробы смеси разделяемых компонентов в колонку с достаточно высокой воспроизводимостью. Простые системы ввода пробы - "stop-flow" требуют остановки насоса и, поэтому, менее удобны, чем петлевые дозаторы, разработанные фирмой Reodyne.

Колонки (4) для ВЭЖХ представляют собой толстостенные трубки из нержавеющей стали, способные выдержать высокое давление. Большую роль играет плотность и равномерность набивки колонки сорбентом. Для жидкостной хроматографии низкого давления с успехом используют толстостенные стеклянные колонки. Постоянство температуры обеспечивается термостатом (5).

Детекторы (6) для жидкостной хроматографии имеют проточную кювету, в которой происходит непрерывное измерение какого-либо свойства протекающего элюента. Наиболее популярными типами детекторов общего назначения являются рефрактометры, измеряющие показатель преломления, и спектрофотометрические детекторы, определяющие оптическую плотность растворителя на фиксированной длине волны (как правило, в ультрафиолетовой области). К достоинствам рефрактометров (и недостаткам спектрофотометров) следует отнести низкую чувствительность к типу определяемого соединения, которое может и не содержать хромофорных групп. С другой стороны, применение рефрактометров ограничено изократическими системами (с постоянным составом элюента), так что использование градиента растворителей в этом случае невозможно.

Колонки для ВЭЖХ, которые чаще всего используют в анализах загрязнителей окружающей среды, имеют длину 25 см и внутренний диаметр 4,6 мм, заполняются они сферическими частицами силикагеля размером 5-10 мкм с привитыми октадецильными группами. В последние годы появились колонки с меньшим внутренним диаметром, заполненными частицами меньшего размера. Использование таких колонок приводит к уменьшению расхода растворителей и продолжительности анализа, увеличению чувствительности и эффективности разделения, а также облегчает проблему подключения колонок к спектральным детекторам. Колонки с внутренним диаметром 3,1 мм снабжают предохранительным картриджем (форколонкой) для увеличения срока службы и улучшения воспроизводимости анализов.

В качестве детекторов в современных приборах для ВЭЖХ используются обычно УФ-детектор на диодной матрице, флуоресцентный и электрохимический.

Следует иметь в виду, что в практической работе разделение часто протекает не по одному, а по нескольким механизмам одновременно. Так, эксклюзионное разделение бывает осложнено адсорбционными эффектами, адсорбционное - распределительными, и наоборот. При этом чем больше различие веществ в пробе по степени ионизации, основности или кислотности, по молекулярной массе, поляризуемости и другим параметрам, тем больше вероятность проявления другого механизма разделения для таких веществ.

На практике, наибольшее распространение получила «обращённофазовая» (распределительная) хроматография, в которой неподвижная фаза не полярна, а подвижная полярна (т. е. обратна «прямофазной» хроматографии).

В большинстве лабораторий мира группу из 16 приоритетных ПАУ анализируют методами ВЭЖХ или ХМС.

ГЛАВА 2. СУЩНОСТЬ ВЭЖХ

В высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) характер происходящих процессов в хроматографической колонке, в общем идентичен с процессами в газовой хроматографии. Отличие состоит лишь в применении в качестве неподвижной фазы жидкости. В связи с высокой плотностью жидких подвижных фаз и большим сопротивлением колонок газовая и жидкостная хроматография сильно различаются по аппаратурному оформлению.

В ВЭЖХ в качестве подвижных фаз обычно используют чистые растворители или их смеси.

Для создания потока чистого растворителя (или смесей растворителей), называемого в жидкостной хроматографии элюентом, используются насосы, входящие в гидравлическую систему хроматографа.

Адсорбционная хроматография осуществляется в результате взаимодействия вещества с адсорбентами, такими как силикагель или оксид алюминия, имеющими на поверхности активные центры. Различие в способности к взаимодействию с адсорбционными центрами разных молекул пробы приводит к их разделению на зоны в процессе движения с подвижной фазой по колонке. Достигаемое при этом разделение зон компонентов зависит от взаимодействия, как с растворителем, так и с адсорбентом.

Наибольшее применение в ВЭЖХ находят адсорбенты из силикагеля с разным объемом, поверхностью и диаметром пор. Значительно реже используют оксид алюминия и другие адсорбенты. Основная причина этого:

недостаточная механическая прочность, не позволяющая упаковывать и использовать при повышенных давлениях, характерных для ВЭЖХ;

силикагель по сравнению с оксидом алюминия обладает более широким диапазоном пористости, поверхности и диаметра пор; значительно большая каталитическая активность оксида алюминия приводит к искажению результатов анализа вследствие разложения компонентов пробы либо их необратимой хемосорбции.

Детекторы для ВЭЖХ

Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) используется для детектирования полярных нелетучих веществ, которые по каким-либо причинам не могут быть переведены в форму удобную для газовой хроматографии, даже в виде производных. К таким веществам, в частности, относят сульфоновые кислоты, водорастворимые красители и некоторые пестициды, например производные фенил - мочевины.

Детекторы:

УФ - детектор на диодной матрице. «Матрица» фотодиодов (их более двухсот) постоянно регистрирует сигналы в УФ- и видимой области спектра, обеспечивая таким образом запись УФ-В-спектров в режиме сканирования. Это позволяет непрерывно снимать при высокой чувствительности неискаженные спектры быстро проходящих через специальную ячейку компонентов.

По сравнению с детектированием на одной длине волны, которое не дает информации о «чистоте» пика, возможности сравнения полных спектров диодной матрицы обеспечивают получение результата идентификации с гораздо большей степенью достоверности.

Флуоресцентный детектор. Большая популярность флуоресцентных детекторов объясняется очень высокой селективностью и чувствительностью, и тем фактором, что многие загрязнители окружающей среды флуоресцируют (например, полиароматические углеводороды).

Электрохимический детектор используются для детектирования веществ, которые легко окисляются или восстанавливаются: фенолы, меркаптаны, амины, ароматические нитро- и галогенпроизводные, альдегиды кетоны, бензидины.

Хроматографическое разделение смеси на колонке вследствие медлен-ного продвижения ПФ занимает много времени. Для ускорения процесса хроматографирование проводят под давлением. Этот метод называют вы-сокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЖХ)

Модернизация аппаратуры, применяемой в классической жидкостной колоночной хроматографии, сделала ее одним из перспективных и совре-менных методов анализа. Высокоэффективная жидкостная хроматография является удобным способом разделения, препаративного выделения и про-ведения качественного и количественного анализа нелетучих термола-бильных соединений как с малой, так с большой молекулярной массой.

В зависимости от типа применяемого сорбента в данном методе используют 2 варианта хроматографирования: на полярном сорбенте с использованием неполярного элюента (вариант прямой фазы) и на неполярном сорбенте с использованием полярного элюента - так называемая обращенно-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография (ОфВЖХ).

При переходе элюента к элюенту равновесие в условиях ОфВЖХ устанавливается во много раз быстрее, чем в условиях полярных сорбентов и неводных ПФ. Вследствие этого, а также удобства работы с водными и водно-спиртовыми элюентами, ОфВЖХ получила в настоящее время большую популярность. Большинство анализов при помощи ВЖХ проводят именно этим методом.

Детекторы. Регистрация выхода из колонки отдельного компонента производится с помощью детектора. Для регистрации можно использовать изменение любого аналитического сигнала, идущего от подвижной фазы и связанного с природой и количеством компонента смеси. В жидкостной хроматографии используют такие аналитические сигналы, как светопоглощение или светоиспускание выходящего раствора (фотометрические и флуориметрические детекторы), показатель преломления (рефрактометрические детекторы), потенциал и электрическая проводимость (электрохимические детекторы) и др.

Непрерывно детектируемый сигнал регистрируется самописцем. Хроматограмма представляет собой зафиксированную на ленте самописца по-следовательность сигналов детектора, вырабатываемых при выходе из ко-лонки отдельных компонентов смеси. В случае разделения смеси на внеш-ней хроматограмме видны отдельные пики. Положение пика на хроматограмме используют для целей идентификации вещества, высоту или площадь пика - для целей количественного определения.

2.1 Применение

Наиболее широкое применение ВЭЖХ находит в следующих областях химического анализа (выделены объекты анализа, где ВЭЖХ практически не имеет конкуренции):

Контроль качества продуктов питания - тонизирующие и вкусовые добавки, альдегиды, кетоны, витамины, сахара, красители, консерванты, гормональные препараты, антибиотики, триазиновые, карбаматные и др. пестициды, микотоксины, нитрозоамины, полициклические ароматические углеводороды и т.п.

Охрана окружающей среды - фенолы, органические нитросоединения, моно- и полициклические ароматические углеводороды, ряд пестицидов, главные анионы и катионы.

Криминалистика - наркотики, органические взрывчатые вещества и красители, сильнодействующие фармацевтические препараты.

Фармацевтическая промышленность - стероидные гормоны, практически все продукты органического синтеза, антибиотики, полимерные препараты, витамины, белковые препараты.

Медицина - перечисленные биохимические и лекарственные вещества и их метаболиты в биологических жидкостях (аминокислоты, пурины и пиримидины, стероидные гормоны, липиды) при диагностике заболеваний, определении скорости выведения лекарственных препаратов из организма с целью их индивидуальной дозировки.

Сельское хозяйство - определение нитрата и фосфата в почвах для определения необходимого количества вносимых удобрений, определение питательной ценности кормов (аминокислоты и витамины), анализ пестицидов в почве, воде и сельхозпродукции.

Биохимия, биоорганическая химия, генная инженерия, биотехнология - сахара, липиды, стероиды, белки, аминокислоты, нуклеозиды и их производные, витамины, пептиды, олигонуклеотиды, порфирины и др.

Органическая химия - все устойчивые продукты органического синтеза, красители, термолабильные соединения, нелетучие соединения; неорганическая химия (практически все растворимые соединения в виде ионов и комплексных соединений).

контроль качества и безопасности продуктов питания, алкогольных и безалкогольных напитков, питьевой воды, средств бытовой химии, парфюмерии на всех стадиях их производства;

определение характера загрязнений на месте техногенной катастрофы или чрезвычайного происшествия;

обнаружение и анализ наркотических, сильнодействующих, ядовитых и взрывчатых веществ;

определение наличия вредных веществ (полициклические и другие ароматические углеводороды, фенолы, пестициды, органические красители, ионы тяжелых, щелочных и щелочно-земельных металлов) в жидких стоках, воздушных выбросах и твердых отходах предприятий и в живых организмах;

мониторинг процессов органического синтеза, нефте- и углепереработки, биохимических и микробиологических производств;

анализ качества почв для внесения удобрений, наличия пестицидов и гербицидов в почве, воде и в продукции, а также питательной ценности кормов; сложные исследовательские аналитические задачи; получение микроколичества сверхчистого вещества.

ГЛАВА 3. ПРИМЕРЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ВЭЖХ В АНАЛИЗЕ ОБЪЕКТОВ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ

ВЭЖХ - метод мониторинга ПАУ в объектах окружающей среды

Для полициклических ароматических углеводородов (ПАУ), экотоксикантов 1-го класса опасности, установлены крайне низкие уровни предельно допустимых концентраций (ПДК) в природных объектах. Определение ПАУ на уровне ПДК и ниже относится к числу очень сложных аналитических задач и для их решения применяются высокотехнологичные методы анализа (ГХ-МС, ГХ, ВЭЖХ). При выборе метода для мониторинга к основным рассматриваемым характеристикам – чувствительность и селективность, добавляются экспрессность и экономичность, т.к. мониторинг предполагает проведение серийного анализа. Вариант ВЭЖХ на коротких колонках малого диаметра в значительной степени отвечает указанным требованиям. С применением данного метода авторами разработаны и аттестованы методики контроля бенз[a]пирена в трех природных средах: аэрозоле, снежном покрове и поверхностных водах. Для методик характерны: простая унифицированная подготовка пробы, включающая экстракцию ПАУ органическими растворителями и концентрирование экстракта, прямое введение сконцентрированного экстракта в хроматографическую колонку, применение многоволнового фотометрического детектирования в УФ области спектра, идентификация пиков ПАУ на хроматограммах с применением двух параметров, время удерживания и спектральное отношение. Суммарная погрешность не превышает 10 % при определении бенз[a]пирена в аэрозоле в диапазоне концентраций от 0.3 до 450 нг/м 3 , в поверхностных водах в диапазоне концентраций от 10 до 1000 нг/л, в снежном покрове в диапазоне поверхностной плотности от 0.5 до 50 мкг/м 2 . Для случая одновременного определения приоритетных ПАУ (до 12 соединений) и регистрации негомогенных пиков аналитов предложено повторное разделение экстракта с изменением селективности подвижной фазы, длины волны детектирования и температуры колонки с учетом индивидуальных свойств определяемого ПАУ.

1 . Качество окружающего воздуха. Массовая концентрация бенз[a]пирена. Методика выполнения измерений методом ВЭЖХ. Свидетельство об аттестации МВИ № 01-2000.

2 . Качество поверхностных и очищенных сточных вод. Массовая концентрация бенз[a]пирена. Методика выполнения измерений методом ВЭЖХ. Свидетельство об аттестации МВИ № 01-2001.

3 . Качество снежного покрова. Массовая концентрация бенз[a]пирена. Методика выполнения измерений методом ВЭЖХ. Свидетельство об аттестации МВИ № 02-2001.

Удаление анилина из водных растворов с использованием отходов алюмотермического восстановления прокатной медной окалины

Проблема удаления углеводородов из сточных вод является актуальной задачей. Во многих химических, нефтехимических и других производствах образуются анилин и его производные, которые являются токсичными веществами. Анилин - сильноядовитое вещество, ПДК - 0,1 мг/м 3 . Анилин и его производные растворимы в воде, поэтому не могут быть удалены гравитационным осаждением.

Одним из лучших методов очистки сточных вод от органических загрязнителей является применение неорганических и органических адсорбентов, способных регенерироваться (алюмосиликаты, модифицированные глины, древесина, волокна и т. д.) и неспособных к регенерации(активированный уголь, макропористые полимерные материалы и т. д.).

Регенерируемые адсорбенты могут удалить из воды органические вещества разной полярности. Поиск эффективных адсорбентов является актуальной задачей.

В настоящем сообщении представлены результаты исследования в области применения прокатной медной окалины Ереванского кабельного завода (ОПМОЕрКЗ) в качестве сорбентов анилина.

Хроматографические исследования проводили на хроматографе ВЭЖХ / высокоэффективная жидкостная хроматография / системы (Waters 486 - detector, Waters 600S - controller, Waters 626 - Pump), на колонке 250 х 4 мм наполненными исследуемыми нами сорбентами, скорость мобильной фазы 1 мл/м / мобильной фазой являются исследуемые нами растворители/, детектор - UV-254. УФ-спектроскопический анализ проведен на спектрофотометре «Specord-50», спектры получены с помощью компьютерной программы ASPECT PLUS.

Точно взвешенные порции сорбентов вносили в определенные объемы анилина в воде, начальные концентрации которых варьировали. Смесь тщательно взбалтывали в течение 6 ч. Далее пробу оставляли для отстоя. Адсорбция завершается практически в течение 48 ч. Количество осажденного анилина определено УФ-спектрофотометрическим, а также рефрактометрическим анализом.

Вначале были исследованы адсорбционные свойства ОПМОЕрКЗ при удалении анилина из раствора в тетрахлорметане. Оказалось, что анилин лучше всего поглощает сорбент 3 (таблица).

Проведены также измерения для водных растворов анилина в концентрациях 0,01- 0,0001 моль/л. В таблице приведены данные по 0,01 М раствору.

Поглощение анилина различными сорбентами из 0,01 М водного раствора анилина при 20°С

Ранее было установлено, что адсорбция в указанных пределах концентраций возрастает и линейно зависит от коэффициента преломления. Количество анилина было определено из графической зависимости «коэффициент преломления - молярная концентрация» и скорректировано данными как жидкостной хроматографии, так и УФ-спектрального анализа.

Наиболее активным для водных растворов является сорбент 3. Количество адсорбированного загрязнителя рассчитывалось как разница между общим количеством загрязнителя, добавленного в начальный раствор, и его остатком в конечном растворе.

Методы определения ПАУ в объектах окружающей среды

Как правило для определения ПАУ используются методы газовой хроматографии (ГХ) и высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). разделение основных 16 ПАУ, достаточное для количественного анализа, достигается применением либо капиллярных колонок в газовой хроматографии, либо высокоэффективных колонок применяемых в ВЭЖХ. Необходимо помнить, что колонка, хорошо разделяющая калибровочные смеси шестнадцати ПАУ не гарантирует, что они также хорошо будут разделяться на фоне сопутствующих органических соединений в исследуемых пробах.

В целях упрощения анализа, а также для достижения высокого качества получаемых результатов, большинство аналитических процедур содержит этап предварительного выделения (сепарации) ПАУ среди иных групп сопутствующих соединений в пробах. Чаще всего в этих целях используются методы жидкостной хроматографии низкого давления в системе жидкость-твердое тело или жидкость-жидкость с использованием механизмов адсорбции, например с использованием силикагеля или окиси алюминия, иногда используются смешанные механизмы, например адсорбции и исключения с применением cефадексов.

Использование предварительной очистки проб позволяет при определении ПАУ избежать влияния:

Полностью неполярных соединений, таких, как алифатические углеводороды;

Умеренно и сильно полярных соединений, например, фталанов, фенолов, многоатомных спиртов, кислот;

Высокомолекулярных соединений таких, как, например, смолы.

В высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) используются главным образом два типа детекторов: флуориметрический детектор или спектрофотометрический детектор с фотодиодной линейкой. Предел обнаружения ПАУ при флуориметрическом детектировании очень низкий, что делает этот метод особенно пригодным для определения следовых количеств полиароматических соединений. Однако классические флуориметрические детекторы практически не дают информации о строении исследуемого соединения. Современные конструкции делают возможным регистрацию спектров флуоресценции, которые характеристичны для индивидуальных соединений, но они пока не получили широкого распространения в практике рутинных измерений. Спектрофотометрический детектор с фотодиодной линейкой (ФДЛ) дает возможность регистрации спектров поглощения в УФ- и видимом спектральном диапазоне, эти спектры могут использоваться для идентификации. Аналогичная информация может быть получена с использованием быстросканирующих детекторов.

При выборе аналитической техники, предназначенной для разделения, идентификации и количественного анализа упомянутых ПАУ необходимо учитывать следующие условия:

Уровень определяемых содержаний в исследуемых пробах;

Количество сопутствующих субстанций;

Применяемая аналитическая процедура (методика выполнения измерений);

Возможности серийной аппаратуры.

Разработка методики определения щелочноземельных элементов и магния методом ионной высокоэффективной жидкостной хроматографии

Разработка и совершенствование методов, позволяющих решать задачи анализа вод- важная проблема аналитической химии. Развитие высокоэффективной жидкостной хроматографии высокого давления стимулировало развитие нового направления в ионообменной хроматографии- так называемой ионной хроматографии. Синтез сорбентов для ионной хроматографии затруднен, поскольку к ни предъявляется довольно много требований. В связи с отсутствием коммерчески доступных высокоэффективных катионитов, была использована динамически модифицированная обращеная фаза, для чего был синтезирован модификатор: N-гексадецил-N-деканоил-парамино- беноилсульфокислоты этил- диизопропиламмоний (ДГДАСК), где гидрофобный амин, содержащий группу SO 3 - , способный к катионному обмену. После пропускания раствора модификатора поглощение при l = 260 нм достигало 6,4 единиц оптической плотности (° Е) с выходом на плато. Рассчитанная ионообменная емкость составляет 15,65 мкмоль. Так как катионы щелочноземельных элементов и магния не поглощают в УФ- области спектра, использовалась непрямая УФ- детекция с применением синтезированного УФ- поглощающего элюента 1,4- дипиридинийбутана бромида (ДПБ бромид). Так как галоген- ионы разрушают стальные части колонки, то бромид-ион 1,4- дипиридинийбутана заменили на ацетат- ион. При промывании колонки элюентом происходит замена противоиона модификатора- этилдиизопропиламмония на УФ- поглощающий ион 1,4- дипиридинийбутан. Разделение катионов осуществляли при оптимальной длине волны l = 260 нм на шкале 0,4 А в режиме “складывания шкалы”; полярность самописца меняли на обратную. Разделение всех изучаемых катионов достигнуто при ведении комплексообразующей добавки- щавелевой кислоты. Пределы обнаружения Mg 2+ , Ca 2+ , Sr 2+ , Ba 2+ составляют 8 мкг/л; 16 мкг/л; 34 мкг/л; 72 мкг/л соответственно. В выбранных условиях проанализированы водопроводная вода, содержание Ca 2+ в которой составляет 10,6 +1,9 мг-ион/л, Mg 2+ -2,5 + мг-ион/л. Ошибка воспроизводимости не превышает для Ca 2+ -2,2%, для Mg 2+ – 1,4%.

Анализ комплексов кадмия в окружающей среде

Для изучения механизмов миграции тяжелых металлов в биосфере необходимы данные о химических формах существования металлов в природе. Сложности при анализе соединений одного из самых токсичных металлов - кадмия - связаны с тем, что он образует непрочные комплексы, и при попытке их выделить искажаются природные равновесия. В данной работе соединения кадмия в почве и растениях исследованы при помощи методики, основанной на хроматографическом разделении экстрактов с последующей идентификацией компонентов методами химического анализа. Такой подход позволил не только идентифицировать химические формы кадмия, но и прослеживать их трансформации в объектах окружающей среды.

С кадмием в объектах биосферы координируются ОН-группы углеводов и полифенолов (включая флавоноиды), С=О, фосфаты, NH 2 , NO 2 , SH-группы. Для целей настоящего исследования был составлен набор модельных лигандов, представляющих эти классы соединений. Взаимодействие модельных лигандов с водорастворимыми солями кадмия было исследовано методами УФ спектроскопии и ВЭЖХ.

Для выделения соединений кадмия использовали экстракцию специально подобранными (не образующими комплексов с Cd) растворителями. Так удается отделить кадмий от всех тяжелых металлов, кроме его близкого химического аналога – цинка. Кадмий- и цинк,содержащие пики на хроматограммах полученных экстрактов, выявляли при помощи связывания металлов в виде их дитизонатов. Для отделения от цинка использовали различие в устойчивости комплексов Cd и Zn при рН 6-8. Выделенные соединения Cd идентифицировали методом ВЭЖХ с изменением рН в процессе элюирования. Был выполнен анализ соединений кадмия с компонентами почв и тканей растений, а также идентифицированы вещества, вырабатываемые растениями в ответ на увеличение поступления кадмия из почвы. Показано, что у злаков защитными агентами являются флавоноиды, в частности трицин, у бобовых – алкоксипроизводные цистеина, у крестоцветных – как полифенолы, так и тиолы.

ГЛАВА 4. АППАРАТУРА ДЛЯ ВЭЖХ

CЕРИЯ ACCELA

Новый сверхвысокоэффективный жидкостный хроматограф ACCELA cпособен работать в широчайшем диапазоне сокростей потоков и давлений, обеспечивая как типичное для ВЭЖХ разделение на обычных колонках, так и сверхбыстрое и эффективное разделение на колонках с размером частиц сорбента менее 2 мкм при сверхвысоких давлениях (более 1000 атм.).

Система включает квотернарный градиентный инетрный насос, способный создавать давление свыше 1000 атм и с объемом задержки всего 65 мкл, обеспечивающий высокоскоростное хроматографическое разделение. Автосамплер ACCELA способен работать в цикле инжекции образца 30 секунд и обеспечивает высочайшую воспроизводимость ввода. Диодно-матричный детектор Accela PDA с минимизированным объемом проточной ячейки (2 мкл) оптимизирован для работы в режиме высокоскоростной хроматографии, использует патентованную технологию LightPipe и обеспечивает сохранение симметричной формы пиков, которую дает использование безупречных хроматографической системы и колонок.

Система идеально соединяется с масс-спектрометрами для создания самых мощных и лучших из доступных в мире систем ВЭЖХ/МС.

Колонки для рабты в режиме сверхвысокоэффективной хроматографии с размером зерна 1.9 мкм доступны от Thermo Electron для любых применений

CЕРИЯ TSP

Модульный принцип построения приборов ВЭЖХ позволяет заказчику гибко комплектовать оборудование для решения любых аналитических задач, а при их изменении оперативно и экономично его модифицировать. Широкий выбор модулей включает насосы - от изократического до четырехкомпонентного градиентного, от микроколоночного до полупрепаративного, все доступные детекторы, системы ввода образца - от ручных инжекторов до автосамплеров с возможностью любых манипуляций с образцами, мощное программное обеспечение для обработки результатов измерений и управления всеми модулями системы. Все модули сертифицированы по CSA, TUF/GS, FCC(EMI), VDE (EMI), ISO-9000, они компактны, обладают современным дизайном, просты в управлении, оснащены встроенным дисплеем и системой самодиагностики, позволяют создавать и сохранять в памяти методы задачи параметров. Они соответствуют критериям "Образцовой Лабораторной Практики" (GLP) и занесены в Реестр Измерительных средств РФ. Протоколы измерений выдаются в соответствии с Фармакопеями Англии, США, Германии и Франции.

Модульные системы TSP отличаются высочайшей надежностью и устойчивостью в эксплуатации.

Сочетание модулей обеспечивает аналитика всеми преимуществами интегральной системы, с одной стороны, и гибкостью модульной системы с другой. В какой бы области применений ВысокоЭффективной Жидкостной Хроматографии (ВЭЖХ) -фармакология, биотехнология, анализ объектов окружающей среды, клинический анализ,

Воздух внутри помещений: методы контроля и очистки. Контроль источника вредных веществ и окружающей среды. Газоанализаторы: применение и их современные виды для контроля состава газовой смеси - универсальные фотометрические жидкостные и ленточные.

Мониторинг как система наблюдения и контроля оружающей среды. Методы контроля загрязняющих веществ в объектах окружающей среды.

Разделение анионов методом одноколоночной ионной хроматографии. Изображение структуры частицы ионообменной смолы. Примеры использования ионообменной хроматографии в анализе объектов окружающей среды. Особенности анализа пива методом ионной хроматографии.

Общая характеристика хлорорганических соединений, их основные физико-химические свойства и сферы применения, негативное влияние на окружающую среду, организм животных, рыб и человека. Хлорорганические пестициды в продуктах питания и методы их определения.

Основы планарной (тонкослойной) хроматографии: состояние и перспективы использования современных инструментальных методов анализа пестицидов, хлорорганических пестицидов в воде, продуктах питания, кормах и табачных изделиях хроматографией в тонком слое.

Методы, доступные для отбора проб воздуха в помещении для анализа. Принцип действия колориметрических трубок. Изменение цвета определенного реагента при вступлении в контакт с тем или иным загрязнителем. Обнаружение летучих органических соединений.

Теоретические основы флуометрии (люминисценции), области её применения в анализе объектов окруающей среды и современное оборудование для исследований. Необычайная чувствительность и скорость люминисцентного анализа. Проблемы подвода энергии возбуждения.

Развитие химико-аналитической аппаратуры не только не снимает проблему качества выполняемых измерений, но, напротив, предъявляет все более высокие требования во всех аспектах проведения измерений.

Общие сведения о промышленном объекте. Климатические условия района. Технологическая цепочка. Источники загрязнения и нарушения природной среды. Загрязнение природных вод. Пункты наблюдения качества поверхностных вод. Отбор проб воды и методы анализа.

Широкий спектр органических соединений, вводимых в окружающую среду в процессе хозяйственной деятельности человека, приводит к тому, что данные вещества стали являться основными поллютантами, определяющими характер техногенного загрязнения гидросферы.

Характеристика спектроскопических методов анализа. Сущность экстракционно-фотометрических методов. Примеры использования метода для определения тяжелых металлов в природных водах. Методика выявления бромид-ионов, нитрат–ионов. Современное оборудование.

Понятие и назначение газовой хроматографии, параметры ее удерживания. Время удерживания и удерживаемый объем. Уравнения в газовой хроматографии. Дополнительные устройства для газовой хроматографии. Контроль загрязненности воздуха в чрезвычайных ситуациях.

Понятие и характеристика метода масс-спектрометрии. Масс-спектрометры с двойной фокусировкой в масс-спектрометрии с индуктивно-связанной плазмой. Использование хромато–масс–спектрометрии в идентификации загрязнителей природных сред, оборудование.

Методы оценки загрязнения газовых потоков. Основные требования к отбору проб газа и его анализу и методы измерений. Методы оценки параметрических загрязнений. Методы оценки загрязнения водной среды, почв, грунтов и растительности. Идентификации изменений.

Определение тысячных долей процента содержания вещества в чистых металлах оптическими методами анализа с помощью адсорбционных методов спектрофотомерией, фотоколориметрией и колориметрией. Продажа химико-аналитического оборудования через web-сайты.

Назначение и основные принципы реализации кондуктометрических методов анализа. Разновидности используемых методов и особенности их применения. Примеры использования кондуктометрии в анализе объектов окружающей среды и необходимое для этого оборудование.

Применительно к природным водам рассмотрены проблемы количественного определения и разделения на антропогенную и естественную составляющие углеводородов (СН).

Сорбционные методы очистки воды в настоящее время находят все более широкое применение, и одним из наиболее часто применяемім сорбентом является активный уголь.

Основные виды хроматографии. Применение хроматографических методов в экологическом мониторинге. Применение хроматографии в анализе объектов окружающей среды. Современное аппаратурное оформление. Методы проявления хроматограмм и работа хроматографа.

Мониторинг природных вод физико-химическими методами: планарная (тонкослойная хроматография) и её применение для нализа вод. Разделение смеси веществ в плоском слое сорбента и растворителе. Интенсивность люминесценции нефтепродуктов на флюориметре.

(ОФС 42-0096-09)

Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) – это метод колоночной хроматографии, в котором подвижной фазой (ПФ) служит жид-

кость, движущаяся через хроматографическую колонку, заполненную непод-

вижной фазой (сорбентом). Колонки для ВЭЖХ характеризуются высоким гидравлическим давлением на входе в колонку, поэтому ВЭЖХ иногда назы-

вают «жидкостной хроматографией высокого давления».

В зависимости от механизма разделения веществ различают следую-

щие варианты ВЭЖХ: адсорбционную, распределительную, ионообменную,

эксклюзионную, хиральную и др.

В адсорбционной хроматографии разделение веществ происходит за счет их различной способности адсорбироваться и десорбироваться с по-

верхности адсорбента с развитой поверхностью, например, силикагеля.

В распределительной ВЭЖХ разделение происходит за счет различия коэффициентов распределения разделяемых веществ между неподвижной

(как правило, химически привитой к поверхности неподвижного носителя) и

подвижной фазами.

По полярности ПФ и НФ ВЭЖХ разделяют на нормально-фазовую и об-

ращенно-фазовую.

Нормально-фазовым называют вариант хроматографии, в котором ис-

пользуются полярный сорбент (например, силикагель или силикагель с при-

витыми NH2 - или CN-группами) и неполярная ПФ (например, гексан с раз-

личными добавками). В обращенно-фазовом варианте хроматографии ис-

пользуют неполярные химически модифицированные сорбенты (например,

неполярный алкильный радикал C18 ) и полярные подвижные фазы (например,

метанол, ацетонитрил).

В ионообменной хроматографии молекулы веществ смеси, диссоции-

ровавшие в растворе на катионы и анионы, разделяются при движении через

сорбент (катионит или анионит) за счет их разной скорости обмена с ионны-

ми группами сорбента.

В эксклюзионной (ситовой, гель-проникающей, гель-фильтрационной)

хроматографии молекулы веществ разделяются по размеру за счет их разной способности проникать в поры неподвижной фазы. При этом первыми из ко-

лонки выходят наиболее крупные молекулы (с наибольшей молекулярной массой), способные проникать в минимальное число пор неподвижной фазы,

а последними выходят вещества с малыми размерами м олекул.

Часто разделение протекает не по одному, а по нескольким механи змам одновременно.

Метод ВЭЖХ может применяться для контроля качества любых нега-

зообразных анализируемых веществ. Для проведения анализа используют соответствующие приборы – жидкостные хроматографы.

В состав жидкостного хроматографа обычно входят следующие основ-

ные узлы:

– узел подготовки ПФ, включая емкость с подвижной фазой (или емко-

сти с отдельными растворителями, входящими в состав подвижной фа-

зы) и систему дегазации ПФ;

– насосная система;

– смеситель подвижной фазы (при необходимости);

– система ввода пробы (инжектор);

– хроматографическая колонка (может быть установлена в термостате);

– детектор;

– система сбора и обработки данных.

Насосная система

Насосы обеспечивают подачу ПФ в колонку с заданной постоянной скоростью. Состав подвижной фазы может быть постоянным или меняю-

щимся во время анализа. В первом случае процесс называют изократическим,

а во втором – градиентным. Перед насосной системой иногда устанавливают

фильтры с диаметром пор 0,45 мкм для фильтрации подвижной фазы. Совре-

менная насосная система жидкостного хроматографа состоит из одного или нескольких насосов, управляемых компьютером. Это позволяет менять со-

став ПФ по определенной программе при градиентном элюировании. Сме-

шение компонентов ПФ в смесителе может происходить как при низком дав-

лении (до насосов), так и при высоком давлении (после насосов). Смеситель можно использовать для подготовки ПФ и при изократическом элюировании,

однако более точное соотношение компонентов достигается при предвари-

тельном смешении компонентов ПФ для изократического процесса. Насосы для аналитической ВЭЖХ позволяют поддерживать постоянную скорость подачи ПФ в колонку в интервале от 0,1 до 10 мл/мин при давлении на входе в колонку до 50 МПа. Целесообразно, однако, чтобы это значение не превы-

шало 20 МПа. Пульсации давления минимизируются специальными демп-

ферными системами, входящими в конструкцию насосов. Рабочие детали на-

сосов изготавливаются из коррозионностойких материалов, что позволяет использовать в составе ПФ агрессивные компоненты.

Смесители

По своей конструкции смесители могут быть статическими или дина-

мическими.

В смесителе происходит образование единой подвижной фазы из от-

дельных растворителей, подаваемых насосами, если необходимая смесь не была приготовлена заранее. Смешивание растворителей обычно происходит самопроизвольно, но иногда применяются системы с принудительным сме-

шиванием.

Инжекторы

Инжекторы могут быть универсальными для ввода проб от

1 мкл до 2 мл или дискретными для ввода пробы только определенного объ-

ема. Оба типа инжекторов могут быть автоматическими («автоинжекторы» или «автосэмплеры»). Инжектор для ввода пробы (раствора) расположен не-

посредственно перед хроматографической колонкой. Конструкция инжектора позволяет изменять направление потока ПФ и осуществлять предварительное введение пробы в петлю определенного объема (обычно от 10 до 100 мкл).

Этот объем указан на маркировке петли. Конструкция инжектора позволяет осуществлять замену петли. Для введения анализируемого раствора в неав-

томатический инжектор используется ручной микрошприц с объемом, значи-

тельно превосходящим объем петли. Избыток введенного раствора, не по-

местившийся в петле, сбрасывается, и в колонку вводится точный и всегда одинаковый объем пробы. Ручное неполное заполнение петли снижает точ-

ность и воспроизводимость дозирования и, следовательно, ухудшает точ-

ность и воспроизводимость хроматографического анализа.

Хроматографическая колонка

Хроматографические колонки обычно представляют собой трубки из нержавеющей стали, стекла или пластика, заполненные сорбентом и закры-

тые с обеих сторон фильтрами с диаметром пор 2–5 мкм. Длина аналитиче-

ской колонки в зависимости от механизма хроматографического разделения может находиться в диапазоне от 5 до 60 см и более (обычно она составляет

10–25 см), внутренний диаметр – от 2 до 10 мм (обычно 4,6 мм). Колонки с внутренним диаметром менее 2 мм используются в микроколоночной хрома-

тографии. Используются также капиллярные колонки с внутренним диамет-

ром около 0,3-0,7 мм. Колонки для препаративной хроматографии имеют внутренний диаметр до 50 мм и более.

Перед аналитической колонкой могут устанавливаться короткие ко-

лонки (предколонки) выполняющие различные вспомогательные функции

(чаще – защита аналитической колонки). Обычно анализ проводят при ком-

натной температуре, однако для увеличения эффективности разделения и со-

кращения продолжительности анализа может быть использовано термоста-

тирование колонок при температурах не выше 60 С. При более высоких температурах возможна деструкция сорбента и изменение состава ПФ.

Неподвижная фаза (сорбент)

В качестве сорбентов обычно применяются:

1. Силикагель, оксид алюминия, пористый графит используются в нор-

мально-фазовой хроматографии. Механизм удерживания в данном слу-

чае – обычно адсорбция;

2. Смолы или полимеры с кислотными или основными группами. Область применения – ионообменная хроматография;

3. Пористый силикагель или полимеры (эксклюзионная хроматография);

4. Химически модифицированные сорбенты (сорбенты с привитыми фа-

зами), приготовленные чаще всего на основе силикагеля. Механизм удерживания в большинстве случаев – распределение между подвиж-

ной и неподвижной фазами;

5. Химически модифицированные хиральные сорбенты, например произ-

водные целлюлозы и амилозы, протеины и пептиды, циклодекстрины,

используемые для разделения энантиомеров (хиральная хроматогра-

Сорбенты с привитыми фазами могут иметь различную степень хими-

ческой модификации. Частицы сорбента могут иметь сферическую или не-

правильную форму и разнообразную пористость.

В качестве привитых фаз наиболее часто применяются:

– октильные группы (сорбент октилсилан или С8 );

– октадецильные группы (сорбент октадецилсилан

(ODS) или С18 );

– фенильные группы (сорбент фенилсилан);

– цианопропильные группы (сорбент CN);

– аминопропильные группы (сорбент NH2 );

– диольные группы (сорбент диол).

Наиболее часто анализ выполняют на неполярных привитых фазах в

обращенно-фазовом режиме с применением сорбента С18 .

В некоторых случаях более целесообразно применять нормально-

фазовую хроматографию. При этом используют силикагель или полярные привитые фазы («CN», «NH2 », «диол») в сочетании с неполярными раствори-

Сорбенты с привитыми фазами химически устойчивы при значениях pH от 2,0 до 8,0, если другое специально не оговаривается производителем.

Частицы сорбента могут иметь сферическую или неправильную форму и разнообразную пористость. Размер частиц сорбента в аналитической ВЭЖХ обычно составляет 3–10 мкм, в препаративной ВЭЖХ – до 50 мкм и более.

Используются также монолитные сорбенты.

Высокая эффективность разделения обеспечивается высокой площадью поверхности частиц сорбента (которая является следствием их микроскопи-

ческих размеров и наличия пор), а также равномерностью состава сорбента и плотной и равномерной его упаковкой.

Детекторы

Используются различные способы детектирования. В общем случае ПФ с растворенными в ней компонентами после хроматографической колон-

ки попадает в ячейку детектора, где непрерывно измеряется то или иное ее свойство (поглощение в УФ или видимой области спектра, флуоресценция,

показатель преломления, электропроводность и др.). Полученная при этом хроматограмма представляет собой график зависимости некоторого физиче-

ского или физико-химического параметра ПФ от времени.

Наиболее распространенными являются спектрофотометрические де-

текторы (включая диодно-матричные), регистрирующие изменение оптиче-

ской плотности в ультрафиолетовой, видимой и часто в ближней инфракрас-

ной областях спектра от 190 до 800 или 900 нм. Хроматограмма в этом слу-

чае представляет собой зависимость оптической плотности ПФ от времени.

Традиционно используемый спектрофотометрический детектор позво-

ляет проводить детектирование при любой длине волны в его рабочем диапа-

зоне. Применяются также мультиволновые детекторы, позволяющие прово-

дить детектирование при нескольких длинах волн одновременно.

С помощью диодно-матричного детектора можно не только проводить детектирование сразу по нескольким длинам волн, но и практически мгно-

венно (без сканирования) получать оптический спектр ПФ в любой момент времени, что значительно упрощает качественный анализ разделяемых ком-

понентов.

Чувствительность флуоресцентных детекторов примерно в 1000 раз выше чувствительности спектрофотометрических. При этом используется либо собственная флуоресценция, либо флуоресценция соответствующих производных, если само определяемое вещество не флуоресцирует. Совре-

менные флуоресцентные детекторы позволяют не только получать хромато-

граммы, но и регистрировать спектры возбуждения и флуоресценции анали-

зируемых соединений.

Для анализа образцов, не поглощающих в УФ и видимой областях спектра (например, углеводов), используют рефрактометрические детекторы

(рефрактометры). Недостатки этих детекторов – их низкая (по сравнению со спектрофотометрическими детекторами) чувствительность и значительная температурная зависимость интенсивности сигнала (детектор необходимо термостатировать).

Используются также электрохимические детекторы (кондуктометриче-

ские, амперометрические и др.), масс-спектрометрические и Фурье-ИК-

детекторы, детекторы светорассеивания, радиоактивности и некоторые дру-

Подвижная фаза

В качестве ПФ могут применяться разнообразные растворители – как индивидуальные, так и их смеси.

В нормально-фазовой хроматографии обычно применяются жидкие уг-

леводороды (гексан, циклогексан, гептан) и другие относительно неполярные

растворители с небольшими добавками полярных органических соединений,

которые регулируют элюирующую силу ПФ.

В обращено-фазовой хроматографии в состав ПФ входят полярные ор-

ганические растворители (обычно ацетонитрил и метанол) и вода. Для опти-

мизации разделения часто используют водные растворы с определенным зна-

чением рН, в частности буферные растворы. Применяют добавки неоргани-

ческих и органических кислот, оснований и солей и другие соединения (на-

пример, хиральные модификаторы для разделения энантиомеров на ахираль-

ном сорбенте).

Контроль значения рН необходимо осуществлять отдельно для водного компоненента, а не для его смеси с органическим растворителем.

ПФ может состоять из одного растворителя, часто из двух, при необхо-

димости – из трех и более. Состав ПФ указывают как объемное соотношение входящих в нее растворителей. В отдельных случаях может указываться мас-

совое соотношение, что должно быть специально оговорено.

При использовании УФ-спектрофотометрического детектора ПФ не должна иметь выраженного поглощения при выбранной для детектирования длине волны. Предел прозрачности или оптическая плотность при опреде-

ленной длине волны растворителя конкретного изготовителя часто указыва-

ется на упаковке.

На хроматографический анализ большое влияние оказывает степень чистоты ПФ, поэтому предпочтительно применять растворители, выпущен-

ные специально для жидкостной хроматографии (включая воду).

ПФ и анализируемые растворы не должны содержать нерастворивших-

ся частиц и пузырьков газа. Воду, полученную в лабораторных условиях,

водные растворы, предварительно смешанные с водой органические раство-

рители, а также анализируемые растворы необходимо подвергать тонкой фильтрации и дегазации. Для этих целей обычно применяют фильтрование

под вакуумом через инертный по отношению к данному растворителю или раствору мембранный фильтр с размером пор 0,45 мкм.

Система сбора и обработки данных

Современная система обработки данных представляет собой сопря-

женный с хроматографом персональный компьютер с установленным про-

граммным обеспечением, позволяющим регистрировать и обрабатывать хро-

матограмму, а также управлять работой хроматографа и следить за основны-

ми параметрами хроматографической системы.

Перечень условий хроматографирования, подлежащих указанию

В частной фармакопейной статье должны быть приведены размеры ко-

лонки, тип сорбента с указанием размера частиц, температура колонки (если необходимо термостатирование), объем вводимой пробы (объем петли), со-

став ПФ и способ ее приготовления, скорость подачи ПФ, детектор и усл овия детектирования, описание градиентного режима (если используется), время хроматографирования.

ИОНООБМЕННАЯ И ИОННАЯ ВЭЖХ

Ионообменная хроматография используется для анализа как органиче-

ских (гетероциклические основания, аминокислоты, белки и др.), так и неор-

ганических (различные катионы и анионы) соединений. Разделение компо-

нентов анализируемой смеси в ионообменной хроматографии основано на обратимом взаимодействии ионов анализируемых веществ с ионными груп-

пами сорбента. В качестве сорбентов используются аниониты или катиони-

ты. Эти сорбенты представляют собой, в основном, либо полимерные ионо-

обменные смолы (обычно сополимеры стирола и дивинилбензола с приви-

тыми ионными группами), либо силикагели с привитыми ионообменными группами. Сорбенты с группами -(СН2 )3 N+ Х– используются для разделения анионов, а сорбенты с группами -(СН2 )SО3 – Н+ – для разделения катионов.

Обычно для разделения анионов применяют полимерные смолы, а для разд е-

ления катионов – модифицированные силикагели.

В качестве ПФ в ионообменной хроматографии применяют водные растворы кислот, оснований и солей. Обычно используются буферные рас-

творы, позволяющие поддерживать определенные значения рН. Возможно также использование небольших добавок смешивающихся с водой органиче-

ских растворителей – ацетонитрила, метанола, этанола, тетрагидрофурана.

Ионная хроматография - вариант ионообменной хроматографии, в

котором для определения концентрации ионов анализируемого вещества ис-

пользуется кондуктометрический детектор. Для высокочувствительного оп-

ределения изменений электропроводности проходящей через детектор ПФ фоновая электропроводность ПФ должна быть низкой.

Существуют два основных варианта ионной хроматографии.

Первый из них основан на подавлении электропроводности электроли-

та ПФ с помощью второй ионообменной колонки, находящейся между ана-

литической колонкой и детектором. В этой колонке происходит нейтрализа-

ция ПФ и анализируемые соединения попадают в ячейку детектора в деиони-

зированной воде. Детектируемые ионы являются единственными ионами,

обеспечивающими проводимость ПФ. Недостаток подавляющей колонки – необходимость ее регенерации через достаточно короткие промежутки вре-

мени. Подавляющая колонка может быть заменена непрерывно действую-

щим мембранным подавителем, в котором состав мембраны непрерывно об-

новляется потоком регенерирующего раствора, движущегося в направлении,

противоположном направлению потока ПФ.

Второй вариант ионной хроматографии – одноколоночная ионная хро-

матография. В этом варианте используется ПФ с очень низкой электропро-

водностью. В качестве электролитов широко применяют слабые органиче-

ские кислоты – бензойную, салициловую или изофталевую.

ЭКСКЛЮЗИОННАЯ ВЭЖХ

Эксклюзионная хроматография (гель-хроматография) – особый вариант ВЭЖХ, основанный на разделении молекул по их размерам. Распределение

молекул между неподвижной и подвижной фазами основано на размерах мо-

лекул и частично на их форме и полярности. Для разделения используют по-

ристые сорбенты – полимеры, силикагель, пористые стекла и полисахариды.

Размер частиц сорбентов 5–10 мкм.

Преимуществами пористых стекол и силикагеля являются быстрая диффузия ПФ и молекул анализируемого вещества в поры, устойчивость в различных условиях (даже при высоких температурах). Полимерные сорбен-

ты представляют собой сополимеры стирола и дивинилбензола (это гидро-

фобные сорбенты, используемые с неполярными подвижными фазами) и

гидрофильные гели, получаемые из сульфированного дивинилбензола или полиакриламидных смол.

Возможны два предельных типа взаимодействия молекул с пористой неподвижной фазой. Молекулы, размер которых больше среднего диаметр а пор, вообще не проникают в сорбент и элюируются вместе с подвижной фа-

зой первыми. Молекулы с диаметром значительно меньше размера пор сор-

бента свободно проникают в него, остаются в неподвижной фазе наибольшее время и элюируются последними. Молекулы средних размеров проникают в поры сорбента в зависимости от размера и частично в зависимости от своей формы. Они элюируются с различными временами удерживания между са-

мыми крупными и самыми мелкими молекулами. Разделение компонентов хроматографируемого образца происходит в результате повторяющихся ак-

тов диффузии компонентов образца в поры сорбента, и обратно.

В эксклюзионной хроматографии для характеристики удерживания ис-

пользуется объем удерживания, равный произведению скорости потока ПФ на время удерживания.

Подвижная фаза. Выбор ПФ зависит от типа сорбента. Эксклюзион-

ная хроматография в целом делится на гель-фильтрационную и гель-

проникающую хроматографию.

Метод гель-фильтрационной хроматографии используют для разделе-

ния водорастворимых соединений на гидрофильных сорбентах. Подвижные фазы представляют собой водные буферные растворы с заданным значением рН.

В гель-проникающей хроматографии применяются гидрофобные сор-

бенты и неполярные органические растворители (толуол, дихлорметан, тет-

рагидрофуран). Этот метод используют для анализа соединений, малораство-

римых в воде.

Детекторы. В качестве детекторов в эксклюзионной хроматографии используются дифференциальные рефрактометрические детекторы, а также спектрофотометрические детекторы (в том числе, в ИК-области спектра).

Применяются также вискозиметрический и проточный лазерный детекторы.

Эти детекторы в комбинации с рефрактометром или другим концентрацион-

ным детектором позволяют непрерывно определять молекулярную массу по-

лимера в ПФ.

УЛЬТРАЭФФЕКТИВНАЯ ЖИДКОСТНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ

Ультраэффективная жидкостная хроматография представляет собой вариант жидкостной хроматографии, отличающийся большей эффективно-

стью по сравнению с классической ВЭЖХ.

Особенностью ультраэффективной жидкостной хроматографии являет-

ся использование сорбентов с размером частиц от 1,5 до 2 мкм. Размеры хро-

матографических колонок обычно составляют от 50 до 150 мм в длину и от 1

до 4 мм в диаметре. Объем вводимой пробы может составлять от 1 до 50 мкл.

Хроматографическое оборудование, используемое в классическом ва-

рианте ВЭЖХ, обычно специально адаптировано для этого вида хроматогра-

Оборудование, предназначенное для ультраэффективной жидкостной хроматографии, может использоваться и в классическом варианте ВЭЖХ.

Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) – это метод колоночной хроматографии, в котором подвижной фазой (ПФ) служит жидкость, движущаяся через хроматографическую колонку, заполненную неподвижной фазой (сорбентом). Колонки для ВЭЖХ характеризуются высоким гидравлическим давлением на входе в колонку, поэтому ВЭЖХ иногда называют «жидкостной хроматографией высокого давления».

В зависимости от механизма разделения веществ различают следующие варианты ВЭЖХ: адсорбционную, распределительную, ионообменную, эксклюзионную, хиральную и др.

В адсорбционной хроматографии разделение веществ происходит за счет их различной способности адсорбироваться и десорбироваться с поверхности адсорбента с развитой поверхностью, например, силикагеля.

В распределительной ВЭЖХ разделение происходит за счет различия коэффициентов распределения разделяемых веществ между неподвижной (как правило, химически привитой к поверхности неподвижного носителя) и подвижной фазами.

По полярности ПФ и НФ ВЭЖХ разделяют на нормально-фазовую и обращенно-фазовую.

Нормально-фазовым называют вариант хроматографии, в котором используются полярный сорбент (например, силикагель или силикагель с привитыми NH 2 - или CN-группами) и неполярная ПФ (например, гексан с различными добавками). В обращенно-фазовом варианте хроматографии используют неполярные химически модифицированные сорбенты (например, неполярный алкильный радикал C 18) и полярные подвижные фазы (например, метанол, ацетонитрил).

В ионообменной хроматографии молекулы веществ смеси, диссоциировавшие в растворе на катионы и анионы, разделяются при движении через сорбент (катионит или анионит) за счет их разной скорости обмена с ионными группами сорбента.

В эксклюзионной (ситовой, гель-проникающей, гель-фильтрационной) хроматографии молекулы веществ разделяются по размеру за счет их разной способности проникать в поры неподвижной фазы. При этом первыми из колонки выходят наиболее крупные молекулы (с наибольшей молекулярной массой), способные проникать в минимальное число пор неподвижной фазы, а последними выходят вещества с малыми размерами молекул.

часто разделение протекает не по одному, а по нескольким механизмам одновременно.

Метод ВЭЖХ может применяться для контроля качества любых негазообразных анализируемых веществ. Для проведения анализа используют соответствующие приборы – жидкостные хроматографы.

В состав жидкостного хроматографа обычно входят следующие основные узлы:

– узел подготовки ПФ, включая емкость с подвижной фазой (или емкости с отдельными растворителями, входящими в состав подвижной фазы) и систему дегазации ПФ;

– насосная система;

– смеситель подвижной фазы (при необходимости);

– система ввода пробы (инжектор);

– хроматографическая колонка (может быть установлена в термостате);

– детектор;

– система сбора и обработки данных.

Насосная система

Насосы обеспечивают подачу ПФ в колонку с заданной постоянной скоростью. Состав подвижной фазы может быть постоянным или меняющимся во время анализа. В первом случае процесс называют изократическим, а во втором – градиентным. Перед насосной системой иногда устанавливают фильтры с диаметром пор 0,45 мкм для фильтрации подвижной фазы. Современная насосная система жидкостного хроматографа состоит из одного или нескольких насосов, управляемых компьютером. Это позволяет менять состав ПФ по определенной программе при градиентном элюировании. Смешение компонентов ПФ в смесителе может происходить как при низком давлении (до насосов), так и при высоком давлении (после насосов). Смеситель можно использовать для подготовки ПФ и при изократическом элюировании, однако более точное соотношение компонентов достигается при предварительном смешении компонентов ПФ для изократического процесса. Насосы для аналитической ВЭЖХ позволяют поддерживать постоянную скорость подачи ПФ в колонку в интервале от 0,1 до 10 мл/мин при давлении на входе в колонку до 50 МПа. Целесообразно, однако, чтобы это значение не превышало 20 МПа. Пульсации давления минимизируются специальными демпферными системами, входящими в конструкцию насосов. Рабочие детали насосов изготавливаются из коррозионностойких материалов, что позволяет использовать в составе ПФ агрессивные компоненты.

Содержащий смесь образца через колонку, заполненную твердым адсорбирующим материалом . Каждый компонент в образце взаимодействует несколько иначе, с адсорбирующим материалом, в результате чего различные скорости потока для различных компонентов и приводит к разделению компонентов, поскольку они вытекают из колонны.

ВЭЖЙ были использовано для изготовления (например , в процессе производства фармацевтических и биологических продукты), правовой (например , обнаружение наркотиков повышения производительности в моче), исследование (например , разделение компонентов комплексного биологического образца, или аналогичных синтетических химических веществ друг от друга), и медицинской (например , обнаруживать уровни витамина D в сыворотке крови) цели.

Использование более полярных растворителей, в подвижной фазе, будет уменьшать время удерживания аналитов, в то время как более гидрофобные растворители, как правило, вызывают более медленные элюирования (увеличение времени удерживания). Очень полярные растворители, такие как следы воды в подвижной фазе, как правило, адсорбируются на твердую поверхность неподвижной фазы, образующей неподвижный слой связанного (воду) , который считается играть активную роль в сохранении. Такое поведение является несколько свойственный нормальной фазовой хроматографии, поскольку она регулируется почти исключительно с помощью механизма адсорбционного (т.е. , аналитов взаимодействуют с твердой поверхностью, а не с сольватированного слоем лиганда, прикрепленной к поверхности сорбента; смотри также обращенно-фазовой ВЭЖХ ниже). Адсорбционная хроматография до сих пор широко используются для структурных изомеров разделений в обеих столбцах и тонкослойных форматах хроматография на активированном (высушенный) кремнезем или глинозем опоре.

Partition- и НП-ВЭЖХ выпал из пользу в 1970 - х с развитием обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии из - за плохой воспроизводимости времени удерживания в связи с наличием воды или протонном слоя органического растворителя на поверхности диоксида кремния или оксида алюминия хроматографических сред, Этот слой изменяет с любыми изменениями в составе подвижной фазы (например , уровень влажности) , что вызывает дрейфующих времена удерживания.

В последнее время, распределительная хроматография стала популярной снова с развитием Hilic скрепленных фаз, которые демонстрируют улучшенные воспроизводимости, и из - за лучшее понимание диапазона полезности техники.

Объем хроматографии

Вытеснительной хроматографии

Размер-эксклюзионной хроматографии (SEC), также известный как гель - проникающей хроматографии или гель - фильтрационной хроматографии , отделяет частицы на основе молекулярного размера (на самом деле с помощью частицы радиуса Стокса). Это, как правило, разрешение хроматография низкая и, таким образом, он часто зарезервирован для окончательной полировки, «» стадии очистки. Это также полезно для определения третичной структуры и четвертичной структуры очищенных белков. SEC используется в основном для анализа больших молекул, таких как белки или полимеры. SEC работает за счет захвата этих меньших молекул в порах частицы. Более крупные молекулы просто проходят мимо пор, как они слишком велики, чтобы войти в поры. Поэтому крупные молекулы, протекать через колонку быстрее, чем более мелкие молекулы, то есть, чем меньше молекула, тем дольше время удерживания.

Этот метод широко используется для определения молекулярной массы полисахаридов. SEC является официальным метод (предложенный Европейской фармакопее) для молекулярного веса по сравнению различных коммерчески доступных низкомолекулярных гепаринов .

Ионообменная хроматография

В ионообменной хроматографии (IC), удержание на основе притяжения между ионами растворенным веществом и заряженными объектами, связанными с неподвижной фазой. Ионы растворенных веществ одного и того же заряда как заряженные участки на колонке исключается из связывания, в то время как растворенные ионы противоположного заряда заряженных участков колонны удерживаются на колонке. Ионы растворенных веществ, которые сохраняются на колонке, можно элюировать с колонки путем изменения условий растворителя (например , увеличение ионной эффект системы растворителей путем увеличения концентрации соли в растворе, повышение температуры колонки, изменения рН растворителя, так далее.).

Типы ионообменников включают в себя полистирольные смолы, целлюлозы и декстрана ионообменников (гели), а также с контролируемым пористое стекло или пористый диоксид кремни. Полистирольные смолы позволяют кросс связь, которая увеличивает стабильность цепи. Выше поперечное сцепление уменьшает сворачивание, что увеличивает время установления равновесия и в конечном счете повышает селективность. Целлюлоза и декстраны иониты обладают большим размером пор и плотности низкого заряда делают их пригодными для разделения белков.

В общем, ионообменники пользу связывания ионов большего заряда и меньшего радиуса.

Узкий расточки колонны (1-2 мм) используются для применений, когда больше чувствительности желательно либо с помощью специальных UV-VIS детекторы, флуоресценции обнаружения или с помощью других методов обнаружения, как для жидкостной хроматографии-масс - спектрометрии

Капиллярных колонок (до 0,3 мм) используются почти исключительно с альтернативным средства обнаружения, таких как масс - спектрометрии . Они, как правило, изготовлены из плавленого кварца капилляров, а не трубки из нержавеющей стали, что большие колонны нанимать.

Размер частицы

Большинство традиционных ВЭЖХ проводят с неподвижной фазой, прикрепленной к внешней стороне небольших сферических кварцевых частиц (очень маленьких шариков). Эти частицы бывают различных размеров с 5 мкм бусин являются наиболее распространенными. Более мелкие частицы обычно обеспечивают большую площадь поверхности и более разделения, но давление, необходимое для достижения оптимального линейного увеличения скорости по обратной величине диаметра частиц в квадрате.

Это означает, что изменение к частицам, которые в два раза большим, сохраняя размер столбца то же самое, удвоит производительность, но увеличивают требуемое давление, в четыре раза. Более крупные частицы используют в препаративной ВЭЖХ (колонка диаметром 5 см до> 30 см) , и для не-ВЭЖХ приложений, таких как твердофазной экстракции .

размер пор

Многие стационарные фазы являются пористыми, чтобы обеспечить большую площадь поверхности. Малые поры обеспечивают большую площадь поверхности, в то время как больший размер пор имеет лучшую кинетику, особенно для больших аналитов. Например, белок, который лишь немного меньше, чем поры может ввести поры, но не легко оставить один раз внутри.

давление насоса

Жидкостно-адсорбционная хроматография на колонке

Разделение смеси веществ в адсорбционной колонке происходит в результате различия их в сорбируемости на данном адсорбенте (в соответствии с законом адсорбционного замещения, установленного М. С. Цветом).

Адсорбентами являются пористые тела с сильно развитой внутренней поверхностью, удерживающие жидкости с помощью межмолекулярных и поверхностных явлений. Это могут быть полярные и неполярные неорганические и органические соединения. К полярным адсорбентам относятся силикагель (высушенная желатинообразная двуокись кремния), оксид алюминия, карбонат кальция, целлюлоза, крахмал и др. Неполярные сорбенты - активированный уголь, порошок резины и множество других, полученных синтетическим путем.

К адсорбентам предъявляют следующие требования: S они не должны вступать в химические реакции с подвижной фазой и разделяемыми веществами; S должны обладать механической прочностью; S зерна адсорбента должны быть одинаковой степени дисперсности.

При выборе условий для хроматографического процесса учитывают свойства адсорбента и адсорбируемых веществ.

В классическом варианте жидкостной колоночной хроматографии (ЖКХ) через хроматографическую колонку, представляющую собой стеклянную трубку диаметром 0,5 - 5 см и длиной 20 - 100 см, заполненную сорбентом (НФ), пропускают элюент (ПФ). Элюент движется под воздействием силы тяжести. Скорость его движения можно регулировать имеющимся внизу колонки краном. Анализируемую смесь помещают в верхнюю часть колонки. По мере продвижения пробы по колонке происходит разделение компонентов. Через определенные промежутки времени отбирают фракции выделившегося из колонки элюента, который анализируют каким-либо методом, позволяющим измерять концентрации определяемых веществ.

Колоночная адсорбционная хроматография в настоящее время применяется, главным образом не как самостоятельный метод анализа, а как способ предварительного (иногда и конечного) разделения сложных смесей на более простые, т.е. для подготовки к анализу другими методами (в том числе и хроматографическими). Например, на колонке с окисью алюминия разделяют смесь токоферолов, пропускают элюент и собирают фракцию а-токоферола для последующего определения фотометрическим методом.

Хроматографическое разделение смеси на колонке вследствие медленного продвижения ПФ занимает много времени. Для ускорения процесса хроматографирование проводят под давлением. Этот метод называют высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЖХ)

Модернизация аппаратуры, применяемой в классической жидкостной колоночной хроматографии, сделала ее одним из перспективных и современных методов анализа. Высокоэффективная жидкостная хроматография является удобным способом разделения, препаративного выделения и проведения качественного и количественного анализа нелетучих термолабильных соединений как с малой, так с большой молекулярной массой.

В зависимости от типа применяемого сорбента в данном методе используют 2 варианта хроматографирования: на полярном сорбенте с использованием неполярного элюента (вариант прямой фазы) и на неполярном сорбенте с использованием полярного элюента - так называемая об-ращенно-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография (Оф ВЖХ).

При переходе элюента к элюенту равновесие в условиях ОфВЖХ устанавливается во много раз быстрее, чем в условиях полярных сорбенгов и неводных ПФ. Вследствие этого, а также удобства работы с водными и водно-спиртовыми элюентами, ОфВЖХ получила в настоящее время большую популярность. Большинство анализов при помощи ВЖХ проводят именно этим методом.

Аппаратура для ВЖХ

Комплект современного оборудования для ВЖХ, как правило, состоит из двух насосов 3,4 (рис. 7.1.1.1), управляемых микропроцессором 5, и подающих элюент по определенной программе. Насосы создают давление до 40 МПа. Проба вводится через специальное устройство (инжектор) 7 непосредственно в поток элюента. После прохождения через хроматографическую колонку 8 вещества детектируются высокочувствительным проточным детектором 9, сигнал которого регистрируется и обрабатывается микро-ЭВМ 11. При необходимости, в момент выхода пика автоматически отбираются фракции.

Колонки для ВЖХ выполняют из нержавеющей стали с внутренним диаметром 2 - 6 мм и длиной 10-25 см. Колонки заполняют сорбентом (НФ). В качестве НФ используются силикагель, оксид алюминия или модифицированные сорбенты. Модифицируют обычно силикагель, внедряя химическим путем в его поверхность различные функциональные группы.

Детекторы. Регистрация выхода из колонки отдельного компонента производится с помощью детектора. Для регистрации можно использовать изменение любого аналитического сигнала, идущего от подвижной фазы и связанного с природой и количеством компонента смеси. В жидкостной хроматографии используют такие аналитические сигналы, как светопоглощение или светоиспускание выходящего раствора (фотометрические и флуориметрические детекторы), показатель преломления (рефрактометрические детекторы), потенциал и электрическая проводимость (электрохимические детекторы) и др.

Непрерывно детектируемый сигнал регистрируется самописцем. Хро-матограмма представляет собой зафиксированную на ленте самописца последовательность сигналов детектора, вырабатываемых при выходе из колонки отдельных компонентов смеси. В случае разделения смеси на внешней хроматограмме видны отдельные пики. Положение пика на хромато-грамме используют для целей идентификации вещества, высоту или площадь пика - для целей количественного определения.

Качественный анализ

Важнейшие характеристики хроматограммы - время удерживания tR и связанный с ней удерживаемый объем - отражают природу веществ, их способность к сорбции на материале неподвижной фазы и, следовательно, при постоянстве условий хроматографирования являются средством идентификации вещества. Для данной колонки с определенными скоростью потока и температурой время удерживания каждого соединения постоянно (рис.7.1.1.2), где t.R(A) - время удерживания компонента А анализируемой смеси с момента ввода в колонку до появления на выходе из колонки максимума пика, 1К(вс) - время удерживания внутреннего стандарта (первоначально отсутствующее в анализируемой смеси вещество), h - высота пика (мм), аш - ширина пика на половине его высоты, мм.

Для идентификации вещества по хроматограмме обычно используют стандартные образцы или чистые вещества. Сравнивают время удерживания неизвестного компонента IR* с временем удерживания IRCT известных веществ. Но более надежна идентификация по измерению относительного времени удерживания

При этом в колонку сначала вводят известное вещество (внутренний стандарт) и измеряют время его удерживания tR(Bc), затем хроматографиче-ски разделяют (хроматографируют) исследуемую смесь, в которую предварительно добавляют внутренний стандарт. Относительное время удерживания определяют по формуле (7.1.1.1).

Количественный анализ

В основе этого анализа лежит зависимость высоты пика h или его площади S от количества вещества. Для узких пиков предпочтительнее измерение h, для широких размытых - S. Площадь пика измеряют разными способами: умножением высоты пика (h) на его ширину (ai/2), измеренную на половине его высоты (рис.7.2.3); планиметрированием; с помощью интегратора. Электрическими или электронными интеграторами снабжены современные хроматографы.

Для определения содержания веществ в пробе используют в основном три метода: метод абсолютной градуировки, метод внутренней нормализации и метод внутреннего стандарта.

Метод абсолютной градуировки основан на предварительном определении зависимости между количеством введенного вещества и площадью или высотой пика на хроматограмме. В хроматограмму вводят известное количество градуировочной смеси и определяют площади или высота полученных пиков. Строят график зависимости площади или высоты пика от количества введенного вещества. Анализируют исследуемый образец, измеряют площадь или высоту пика определяемого компонента и на основании градировочного графика рассчитывают его количество.

Этот метод дает информацию только об относительном содержании компонента в смеси, но не позволяет определить его абсолютную величину.

Метод внутреннего стандарта основан на сравнении выбранного параметра пика анализируемого вещества с тем же параметром стандартного вещества, введенного в пробу в известном количестве. В исследуемую пробу вводят известное количество такого стандартного вещества, пик которого достаточно хорошо отделяется от пиков компонентов исследуемой смеси

В последних двух методах требуется введение поправочных коэффициентов, характеризующих чувствительность используемых детекторов к анализируемым веществам. Для разных типов детекторов и разных веществ коэффициент чувствительности определяется экспериментально.

В жидкостной адсорбционной хроматографии используется также анализ фракций растворов, собранных в момент выхода вещества из колонки. Анализ может быть проведен различными физико-химическими методами.

Жидкостную адсорбционную хроматографию применяют в первую очередь для разделения органических веществ. Этим методом весьма успешно изучают состав нефти, углеводородов, эффективно разделяют-транс- и цис- изомеры, алкалоиды и др. С помощью ВЖХ можно определять красители, органические кислоты, аминокислоты, сахара, примеси пестицидов и гербицидов, лекарственных веществ и других загрязнителей в пищевых продуктах.